การสกัดดีเอ็นเอจากเลือด (DNA isolation from blood)


อาจารย์ นายสัตวแพทย์ กรกฎ งานวงศ์พาณิชย์

 

ในเลือดของสัตว์แต่ละชนิดนั้นจะมีกระบวนการสำหรับการสกัด DNA ไม่เหมือนกัน เนื่องจากลักษณะทางจุลกายวิภาคของเลือดไม่เหมือนกัน กล่าวคือ ในสัตว์ปีก (avian) หรือสัตว์เลื้อยคลาน (reptile) การสกัด DNA สามารถทำได้โดยตรงเนื่องจากในเม็ดเลือดทุกชนิดของสัตว์เหล่านี้มีนิวเคลียส (nucleus)ในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม (mammal) เฉพาะเม็ดเลือดขาวเท่านั้นที่มีนิวเคลียส การสกัด DNA นั้นจึงต้องทำการแยกเอาเฉพาะส่วนที่เป็นเม็ดเลือดขาว (white blood cell ) ออกมาใช้สำหรับการสกัด

การสกัดดีเอ็นเอจากเลือดสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม

กรรมวิธีในการเก็บตัวอย่างมาสกัดก็นับว่าเป็นปัจจัยที่สำคัญปัจจัยหนึ่ง ในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมนั้น ตัวอย่างเลือดที่นำมาใช้สกัดต้องใส่สารป้องกันการแข็งตัวของเลือด (anticoagulante) ที่นิยมใช้คือ EDTA (500 ul of 0.5 M EDTA / 15 ml of blood sample) และควรนำมาทำการสกัดทันทีภายหลังจากการเก็บ นอกจากนั้นควรระวังไม่ให้เม็ดเลือดแดง (red blood cell) แตกในขณะที่ทำการเก็บซึ่งจะทำให้สามารถแยกเม็ดเลือดขาวออกมาได้น้อย สาเหตุที่สำคัญที่มักทำให้เม็ดเลือดแดงแตกในขณะทำการเก็บเลือดได้แก่

  1. การใช้ เข็มที่มีขนาดเล็กเกินไป
  2. การดูดเลือดจากร่างกายสัตว์เข้าสู่กระบอกเก็บเลือด (syring) และการไล่เลือดจากกระบอกเก็บเลือดเข้าหลอดเก็บเลือดกระทำด้วยความเร็วและรุนแรงเกินไป ในการไล่เลือดออดจากกระบอกเก็บเลือดเข้าสู่หลอดเก็บเลือดนั้นควรทำการถอดปลายเข็มออกก่อน
  3. ในขณะที่ทำการเก็บตัวอย่างเลือด สัตว์อยู่ในสภาวะเครียดมากเกินไป มีการต่อสู้ดิ้นรนอย่างรุนแรงก็ทำให้เม็ดเลือดแดงแตกได้

สารเคมี

  1. 0.5 M EDTA
  2. 9% NaCl
  3. Lysis buffer (100 ml)
    1. 100 mM NaCl (9%) ............6.5 ml
    2. 50 mM Tris pH7.5...............5.0 ml
    3. 0.1mM EDTA pH 8.0..........200 ul
    4. 10 % SDS...........................1 ml
    5. Mercaptoethanol...............2 ml
    6. Water....until...................... 100 ml
  4. Proteinase K
  5. Phenal:Chloroform (1:1)
  6. Chloroform
  7. 3 M Sodium acetate (NaAc) pH 5.8
  8. Isopropanal or 100% Ethanol
  9. 75% Ethanol
  10. TE buffer (for 50 ml)
    1. Tri HCl pH8.0......................500 ul
    2. 0.5 M EDTA........................100 ul
    3. Water...until.........................50 ml

ขันตอนการสกัดแยก DNA จากเลือด

วันที่ 1

  1. ทำการปั่นตก (centrifuge) ด้วยความเร็ว 1,100 rpm เป็นเวลา 30 นาที เพื่อแยกชั้นต่างๆของเลือด
  2. เมื่อการปั่นสมบูรณ์ จะเห็นเลือดแบ่งออกเป็น 3 ชั้นอย่างชัดเจน ชั้นบนสุดเป็นของเหลวใสสีเหลืองคือส่วนที่เรียกว่าน้ำเลือด (serum) ถัดลงมาเป็นชั้นบางๆสีขาว (buffy coat layer) เป็นตำแหน่งของเม็ดเลือดขาว ถัดมาจะเป็นชั้นของเม็ดเลือดแดงที่อัดตัวกันอยู่แน่น ใช้หลอดขนาดเล็ก (pasture pipet) ดูดเอาเฉพาะส่วนของเม็ดเลือดขาวมาใส่ในหลอดขนาด 15 ml ระวังให้มีการปนของเม็ดเลือดแดงน้อยที่สุดเท่าที่จะทำได้
  3. เติมน้ำ 9 ml ผสมให้เข้ากับเม็ดเลือดขาวโดยการพลิกหลอดไปมาประมาณ 20 วินาที จากนั้นเติม 9%NaCl ลงไป 1 ml ทำการผสมให้เข้ากันโดยพลิกหลอดไปมาเช่นกัน
  4. ทำการปั่นตกด้วยความเร็ว 1,100 rpm เป็นเวลา 15 นาที เทส่วนที่เป็นของเหลวทิ้ง เพื่อแยกเอาส่วนของเซลล์เม็ดเลือดขาวที่แตกออก รวมทั้งส่วนของเม็ดเลือดแดงที่ปนเบื้อนมา ส่วนของตะกอนที่ได้จะเป็น DNA
  5. ทำขั้นตอนที่ 3 และ 4 ซ้ำถ้ายังพบว่ามีเม็ดเลือดแดงปนอยู่ใน DNA ที่ก้นหลอด
  6. เติม Lysis buffer 700 ul และ Proteinase K 20 ul ผสมให้เข้ากัน
  7. Incubate ในเครื่อง Shaking incubator ที่ 50 องศาเซลเซียลความเร็ว 100 rpm ข้ามคืน

วันที่ 2

  1. เติม Phenol:Chloroform (1:1) ในปริมาณที่เท่ากับปริมาณสารละลายในหลอด (ประมาณ 750 ul) เขย่าให้เข้ากันหรืออาจใช้ Vertex ก็ได้ จากนั้นนำไปปั่นตกที่ความเร็ว 1,100 rpm เป็นเวลา 10 นาที
  2. หลังจากการปั่นจะได้สารแยกกันเป็นสองชั้นโดยชั้นล่างจะเป็นส่วนของ Phenol:Chloroform สำหรับ DNA จะปนอยู่กับสารที่อยู่ชั้นบน ให้เอาเฉพาะสารที่อยู่ชั้นบนไปใส่ในหลอดขนาด 2 ml
  3. หากพบว่า สารละลายที่ได้มีชิ้นส่วนของเซลล์ปนอยู่มาก คือสารละลายที่ได้ไม่ใส ให้ทำตามขั้นตอนที่ 1 และ 2 ซ้ำ
  4. เติม Chloroform ในปริมาณที่เท่ากับสารละลายในหลอด เขย่าให้เข้ากันจากนั้นนำไปปั่นตกที่ความเร็ว 12,000 rpm อุณหภูมิ 4องศาเซลเซียน เป็นเวลา 10 นาที
  5. หลังจากการปั่นจะได้สารแยกกันเป็นสองชั้นเช่นกัน โดยชั้นล่างเป็นส่วนของ Chloroform ส่วน DNA จะปนอยู่กับสารที่อยู่ชั้นบน ให้เอาเฉพาะสารชั้นบนไปใส่ในหลอดใหม่ ขนาด 2 ml
  6. ทำการตกตะกอน DNA โดยการเติม 3 M sodium acetate pH5.8 ในปริมาณที่เท่ากับสารที่มีอยู่แล้วในหลอด จากนั้นเติม isopropanal 1 ml หรือ 100% ethanol 2.5 ml ผสมให้เข้ากันโดยพลิกหลอดไปมา จากนั้นนำไปปั่นตกที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียน ความเร็ว 12,000 rpm เป็นเวลา 20 นาที (บาง Lab จะแนะนำให้ตกตะกอน DNA ใน sodium acetate และ isopropanol ทิ้งไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียน เป็นเวลา 1 คืน)
  7. จะเห็น DNA จับเป็นก้อนใสที่ก้นหลอด เอาส่วนที่เป็นสารละลายใสทิ้ง เติม 75 % ethanol 1 ml ปั่นตกที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียน ความเร็ว 12,000 rpm เป็นเวลา 20 นาที
  8. จะเห็น DNA จับเป็นก้อนใสที่ก้นหลอดเช่นเดิม เอาส่วนที่เป็นสารละลายใสทิ้ง ปล่อยให้ ethanol ที่อยู่ใน DNA ระเหยจนแห้ง จากนั้นจึงละลายตะกอนดีเอ็นเอ ด้วย TE buffer 300-500 ul
  9. เก็บ DNA ไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียน